呋喃西林冲洗剂的细菌内毒素检查方法研究

[摘要]　目的　建立呋喃西林冲洗剂的细菌内毒素检查方法。 方法　根据《中国药典》2005年版二部附录收载的细菌内毒素检查方法，采用鲎试剂法对呋喃西林冲洗剂进行干扰试验。 结果　稀释2倍的呋喃西林冲洗剂对细菌内毒素与鲎试剂的反应无干扰，可用灵敏度为0.25 EU/mL的鲎试剂进行细菌内毒素检查。 结论　鲎试剂法可用于呋喃西林冲洗剂的细菌内毒素检查，对其进行质量控制。

[关键词]　呋喃西林冲洗剂；细菌内毒素；鲎试剂；干扰试验

Bacterial endotoxin test in nitrofurazone rinse  YANG Ping, SUN Lu-lu, ZENG Wei-xin

[Key words]　Nitrofurazone rinse; Bacterial endotoxin; Tachypleus amebocyte lysate; Interference test

作者简介：杨平(1980-)，女，药师，硕士。从事专业：药剂学。

Email：guoguokate3@yahoo.com.cn

呋喃西林作为外用消毒剂以前被批准为外用的溶液剂，由于其临床除了用于粘膜、腔道、皮肤炎症外、还用于感染伤口、溃疡面的冲洗湿敷^[1]，故2009年在北京市药监局下发的医院制剂批准文件中，将其纳入冲洗剂管理。依据《中国药典》2005年版(二部)的规定，冲洗剂应增加细菌内毒素或热原的检查^[2]，但是原来作为溶液剂管理的呋喃西林消毒剂没有关于鲎试剂法检测细菌内毒素的方法学研究，本文参照药典中细菌内毒素检查法的要求^[3]，对我院生产的呋喃西林冲洗剂进行了细菌内毒素检查方法的研究。

1  材料

1.1  仪器  CS101-E电热鼓风干燥箱(重庆四达实验仪器有限公司)，仪表恒温水浴锅(黄骅市综合电器厂)，MSI Minishaker漩涡混匀器(广州IKA公司)；

1.2  试剂  呋喃西林原料药(批号：070401，武汉久安药业有限公司)；呋喃西林冲洗剂(批号20090223、20090313、20090323，北京世纪坛医院)；鲎试剂(TAL，灵敏度：0.25 EU·mL^-1，批号：0810230，湛江博康海洋生物有限公司)；细菌内毒素工作标准品(规格：120EU/支，批号：150601-200862，中国药品生物制品检定所)；内毒素检查用水(BET水，规格：2 ml/支，批号：080905，湛江博康海洋生物有限公司)。

2  方法与结果

2.1  鲎试剂灵敏度复核实验  按《中国药典》2005年版二部附录细菌内毒素检查法规定，对标示灵敏度为0.25 EU/mL的TAL进行灵敏度复核，结果见表1。

表1 鲎试剂灵敏度复核结果

计算得：λc=lg^-1(∑X/4)=0.25，λc在0.5λ～2λ之间，故该批号鲎试剂可用于细菌内毒素检查，且以标示灵敏度λ=0.25为该批号鲎试剂的灵敏度。

2.2  呋喃西林冲洗剂细菌内毒素限值(L)的确定  《中华人民共和国药典》2005年版(二部)附录IS中规定，冲洗剂的L值应小于0.5 EU/mL^[2]。

2.3  呋喃西林冲洗剂最大有效稀释倍数(MVD)的确定  市售鲎试剂规格为0.03~0.50 EU/mL，按照公式MVD=C L/λ计算，L为0.5 EU/mL。C=1.0ml/ml，λ为鲎试剂的标示灵敏度，计算得MVD_0.06=8.33，MVD_0.125=4，MVD_0.25=2，MVD_0.5=1。

2.4  干扰预试验  称取处方量的呋喃西林、氯化钠及苯甲酸钠，选用市售除热原的灭菌注射用水为溶媒，在层流超净工作台下制备呋喃西林溶液。制备最终稀释倍数为1、2、4、8的溶液，将此系列溶液作为干扰预试验的供试品溶液(NPC)，同时在上述系列溶液中加入含有2λ浓度的细菌内毒素标准溶液作为供试品阳性液(PPC)。取灵敏度(λ)为0.25 EU·mL^-1的鲎试剂与上述PPC和NPC进行反应。每个浓度平行做2支，同时作阳性(PC)和阴性对照(NC)，鲎试剂对不同浓度的样品的测试比较，见表2。

表2 干扰预试验结果

表2的预试验结果表明，呋喃西林原液及各稀释后溶液对鲎试剂与内毒素的反应均无干扰作用。

2.5  干扰试验  为了进一步确认是否存在干扰，进行干扰试验。制备呋喃西林冲洗剂，制备方法同干扰预实验，将此溶液用内毒素检查用水稀释2倍作为干扰试验的供试品，选取灵敏度(λ)为0.25 EU/mL的鲎试剂。以该样品为溶媒，将细菌内毒素工作标准品分别配制成浓度为2λ、1λ、0.5λ和0.25λ的溶液。同时分别以细菌内毒素检查用水和稀释2倍的供试品溶液作阴性对照。按下式计算反应终点浓度的几何平均值(Es和Et)。Es=lg^-1(∑Xs/4)；Et=lg^-1(∑Xt/4)，其中，Xs和Xt分别为BET水和供试品溶液为溶媒组的各反应终点浓度的对数值。结果见表3。

表3 干扰试验结果

结果表明，三批测得的Et/Es均在0.5～2之间，可证明呋喃西林冲洗剂在稀释2倍的浓度下对内毒素与鲎试剂的反应无干扰作用，可用鲎试剂法进行细菌内毒素的检测。

2.6  细菌内毒素检查方法验证  取我院生产的呋喃西林溶液三批，用细菌内毒素检查用水稀释2倍，将稀释后的溶液依照《中华人民共和国药典》2005版“细菌内毒素凝胶法”检查。结果见表4。

表4 细菌内毒素检查结果

三批结果均符合药典的规定。

3  讨论

干扰试验用呋喃西林冲洗剂的配制过程中，必须排除溶媒可能引入的细菌内毒素，故选用除热源的灭菌注射用水为溶媒配制，试验前需将玻璃仪器于250℃下干热灭菌1小时去除内毒素。本试验并未对处方中其他药物单独进行干扰试验考察，故干扰试验结果为呋喃西林冲洗剂处方中呋喃西林、氯化钠及苯甲酸钠对鲎试剂检测方法的干扰结果。

4  结论

呋喃西林冲洗剂在稀释2倍的浓度下对内毒素与鲎试剂的反应无干扰作用，可用灵敏度为0.25 EU·mL^-1的鲎试剂对其进行细菌内毒素的检测，对其进行质量控制。

参考文献：