硼酸冲洗剂中的细菌内毒素检查

[摘要] 目的：建立硼酸冲洗剂的细菌内毒素检查方法。 方法：根据《中国药典》2005年版二部附录收载的细菌内毒素检查方法，采用鲎试剂法对硼酸冲洗剂进行干扰试验。 结果：经2倍稀释并调节pH到6的硼酸冲洗剂对鲎试剂与内毒素的反应无干扰作用，可用灵敏度为0.25EU的鲎试剂进行细菌内毒素检查。 结论：鲎试剂法可用于硼酸冲洗剂的细菌内毒素检查，对其进行质量控制。

[关键词] 硼酸冲洗剂 细菌内毒素 鲎试剂 干扰试验

[Abstract] Objetive: To establish an inspection method for bacterial endotoxin in boric acid rinse. Methods：According to China Pharmacopoeia 2005, the tachypleus amebocyte lysate (TAL) method was applied for the investigation of disturbing and bacterial endotoxin test．Results: there is no interference to the reaction of bacterial endotoxin and TAL with the sensitivity of 0.25 EU·mL^-1 when the sample was 2-fold diluted and adjusted the pH to 6． Conclusion: The TAL method can control the limit of bacteria1endotoxins in boric acid rinse.

[Key words] boric acid rinse; Bacterial endotoxin; Tachypleus amebocyte lysate; Interference test

硼酸溶液为我院自制外用制剂，用于皮肤、粘膜及伤口的消毒，湿敷^[1]，以前被批准为溶液剂管理，2009年在北京市药监局下发的医院制剂批准文件中，将其纳入冲洗剂管理。依据《中国药典》2005年版（二部）的规定，冲洗剂应增加细菌内毒素或热原的检查^[2]。但是原来作为溶液剂管理的硼酸制剂没有关于鲎试剂法检测细菌内毒素的报道，本文参照药典中细菌内毒素检查法的要求^[2]，对我院生产的硼酸冲洗剂进行了细菌内毒素检查方法的研究。

1 仪器与试药

CS101-E电热鼓风干燥箱(重庆四达实验仪器有限公司)，仪表恒温水浴锅(黄骅市综合电器厂)，MSI Minishaker漩涡混匀器(广州IKA公司)。

硼酸原料药（纯度：≥99.5%，批号：080213，北京燕京药业）；硼酸冲洗剂（3%，200ml，批号：20090318、20090320、20090331，北京世纪坛医院）；供干扰预试验及干扰试验用硼酸冲洗剂（3%，200ml，批号：20090311、20090312、20090313、20090316、20090317、20090323，自制）；5%碳酸氢钠注射液（批号：07122441，天津药业焦作有限公司）；鲎试剂（TAL，0.l ml/支，灵敏度：0.25，0.125 EU·ml^-1，批号：0810230，0709050，湛江博康海洋生物有限公司；灵敏度：0.25 EU·ml^-1，0.125 EU·ml^-1，批号：0802201，0903131，湛江安度斯生物有限公司）；细菌内毒素工作标准品（规格：120EU/支，批号：150601-200862，中国药品生物制品检定所）；内毒素检查用水（BET水，规格：2 ml/支，批号：080905，湛江博康海洋生物有限公司）。

2 方法与结果

2.1 鲎试剂灵敏度复核实验

按《中国药典》2005年版二部附录细菌内毒素检查法规定，对不同厂家的标示灵敏度分别为0.25及0.125 EU·mL^-1的TAL进行灵敏度复核试验，另取2管复溶好的0.1ml鲎试剂安瓿，向其中加入0.1ml 的BET水作为阴性对照（NS）结果见表1。

表1 鲎试剂灵敏度复核结果

Tab 1 Sensitivity rechecking result of TAL

表1中，λc根据公式λ_c=lg^-1（∑X/4）计算，结果均在0.5λ～2λ之间，结果均符合规定，故4个批号的鲎试剂均可用于细菌内毒素检查。

2.2 硼酸冲洗剂细菌内毒素限值（L）的确定

《中华人民共和国药典》2005年版（二部）附录IS中规定，冲洗剂的L值应小于0.5 EU·mL^{-1 [2]}。

2.3 硼酸冲洗剂最大有效稀释倍数(MVD)的确定

市售鲎试剂规格为0.03~0.50 EU·mL^-1，按照公式MVD＝C L/λ计算，其中，L为药典规定的最大限值0.5 EU·mL^-1，当L以EU·mL^-1表示时，C为1.0ml·mL^-1，λ为鲎试剂的标示灵敏度，代入上式计算。若使用标示灵敏度为0.06 EU·mL^-1的鲎试剂检测时，MVD_0.06＝8.33（倍），同理，MVD_0.125＝4，MVD_0.25＝2，MVD_0.5＝1。

2.4 干扰预试验

称取处方量的硼酸原料药，选用市售除热原的灭菌注射用水为溶媒，在层流超净工作台环境下制备硼酸溶液，制备最终稀释倍数为1、2、4、8的溶液，用5%的碳酸氢钠注射液分别调节各稀释后溶液的pH至6。将此系列浓度溶液作为供试品溶液（NPC），同时在上述系列溶液中加入含有2λ浓度的细菌内毒素标准溶液作为供试品阳性液（PPC）。取灵敏度（λ）为0.25 EU·mL^-1的不同厂家的鲎试剂与上述PPC和NPC进行反应。每个浓度平行做2支，同时作阳性（PC）和阴性对照（NC），鲎试剂对不同浓度的样品的测试比较，见表2。

表2 干扰预试验结果

Tab 2 result of preliminary interference test

表2的预试验结果表明，调节pH后的硼酸冲洗剂在稀释2倍及以上时对两种鲎试剂与内毒素的反应无干扰作用。

2.5 干扰试验

为了进一步确认是否存在干扰，进行正式干扰试验。制备硼酸溶液，制法同干扰预实验，用内毒素检查用水将其稀释2倍并用5%的碳酸氢钠注射液调节pH至6，将此溶液作为干扰试验的供试品。以该样品为溶媒，将细菌内毒素工作标准品分别配制成浓度为2λ、1λ、0.5λ和0.25λ的溶液。同时分别以细菌内毒素检查用水和供试品溶液作阴性对照。按下式计算反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。Es＝lg^-1（∑Xs/4）；Et＝lg^-1（∑Xt/4），其中，Xs和Xt分别为BET水和供试品溶液为溶媒组的各反应终点浓度的对数值。结果见表3。

表3 干扰试验结果

Tab 3 result of interference test

结果表明，三批测得的Et/Es均在0.5～2之间，可证明硼酸冲洗剂在稀释2倍并调节pH至6时对鲎试剂无干扰作用，可用鲎试剂法对其进行细菌内毒素的检测。

2.6 细菌内毒素检查方法验证

取我院生产的硼酸冲洗剂三批，用灭菌注射用水稀释2倍并用5%的碳酸氢钠注射液调节pH至6，将稀释后的溶液依照《中华人民共和国药典》2005版“细菌内毒素凝胶法”检查。结果见表4。

表4 细菌内毒素检查结果

Tab 4 result of Bacterial endotoxin test

三批结果均符合药典的规定。

3 讨论

供干扰预试验及正式干扰试验用硼酸冲洗剂的配制过程中，必须排除溶媒可能引入的细菌内毒素，故选用除热原的灭菌注射用水为溶媒配制，试验前需将玻璃仪器于250℃下干热灭菌1小时去除内毒素。保证干扰试验结果为硼酸原料对鲎试剂检测方法的的干扰结果。

硼酸冲洗剂原液的PH为4.3，稀释2倍后的PH为5.0，均不在药典鲎试剂法测定内毒素中规定的6～8的范围。曾使用未调节pH的硼酸冲洗剂原液和稀释2倍后的溶液进行干扰试验操作，结果使用上述两种溶液的所有浓度组的所有平行管都未出现胶凝现象，即都显示为阴性结果，可判定上述两种溶液对鲎试剂皆有干扰。故考虑使用碳酸氢钠注射液中和硼酸溶液，将PH调节到6～8的范围。但在实际试验中发现，若调节后的pH超过6.5，则干扰试验也会出现全阴性结果，即也存在干扰，经过反复试验观察、论证，发现将pH调到恰好超过6时，干扰试验的结果显示无干扰。相对于每100 ml稀释后的硼酸冲洗剂，pH调节剂的用量约为0.2 ml，不会影响到样品稀释的倍数，且重复性好，符合药典的规定。

参考文献：

[1] 邵丹，廖银根，叶发舜. 硼酸湿敷药巾的制备及质量控制[J]. 中国药房，2006，17（3）:191.