HPLC法测定复方益母口服液中水苏碱的含量

关键词  水苏碱，复方益母口服液，高效液相色谱法

Abstract  Objective: to establish a HPLC method for the determination of stachydrine in Complex Yimu Koufuye. Methods: Kromasil C₁₈ (5 µm，250 mm×4.6 mm) was used as the solid phase, and CH₃CN- 0.05 mol·L^-1 KDP (18:82, pH 5.5) was used as the mobile phase, with the flow-rate at 1.0 mL·min^-1. Oven temperature was 35℃, and the detective wavelength was 215 nm. Results: stachydrine was well separated from the other impurities, with the standard curve linear range of 1.05 ~ 26.25 µg, r=0.9997. The average recovery of stachydrine was 98.1% (n=9), RSD=1.17%. The repeat experiment was good, with RSD=1.72% (n=5). The accuracy experiment was also good, with RSD=1.23% (n=5). Conclusion: the method is simple, convenient, reliable and sensitive, which could be used as the main quality-control method for the Complex Yimu Koufuye.

Key words  Stachydrine, Complex Yimu Koufuye, HPLC

作为一种传统的妇科良药，益母草性味辛、苦，微寒，具有活血化淤、调经利水之功效，常用于妇女月经不调、痛经、难产，以及跌打损伤、水肿和疮疡肿毒等症。现代药理研究发现，益母草中益母草碱、水苏碱等多种活性生物碱也具有改善心肌缺血、增加冠状动脉血流、提高心功能，抑制血小板聚集、抗凝、抗血栓形成等多种作用，且作用持久^[1]。

复方益母口服液是由益母丸（中国药典1977年版）剂型改进而成，其中主要有效成分水苏碱是益母草中生物碱类含量测定的指标性成分，多采用紫外分光光度法、薄层扫描法和高效毛细管电泳法进行测定，不仅操作过程繁琐、所需时间长，而且水苏碱在湿度大时的稳定性不够理想^[2-5]。本文首次应用高效液相色谱法测定复方益母口服液中主要有效成分水苏碱的含量，方法简便，结果准确可靠，重现性好，可作为控制该制剂质量的主要方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilengt 1200 系列高效液相色谱系统（Agilent Co. Ltd.，USA）：G1376A高效液相泵，G1367B自动进样器，G1316A柱温箱，G1365B多波长UV检测器，Hystar色谱工作站。

1.2 试药

水苏碱对照品（中国药品生物制品检定所提供，110712-200508）；复方益母口服液（山东省临沂银雀山制药厂，10 mL·支^-1，2008211，2008423，2008512）；乙腈（色谱纯，江苏汉邦科技有限公司），水为二次重蒸水，其他试剂均为分析纯（山东禹王化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Kromasil C₁₈ (5 µm，250 mm×4.6 mm，天津琛航科技仪器有限公司提供)；流动相为乙腈-0.05 mol·L^-1磷酸二氢钾溶液（18:82，pH 5.5），流速1.0 mL·min^-1，检测波长215nm，柱温35℃，进样量10 µL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取105℃干燥至恒重的水苏碱适量，置5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得0.5 mg·mL^-1的对照品溶液^[6]，摇匀，备用。

2.3 最大吸收波长的选择

采用岛津UV-160紫外分光光度计，对甲醇配制的0.5 mg·mL^-1的对照品溶液在200~400 nm波长范围内进行扫描，于215 nm处有一个最大吸收特征峰，故选择为检测波长。

2.4 阴性对照溶液的制备

取不含益母草的阴性对照品，按生产厂家提供的生产工艺以及供试品溶液配制方法制备。

2.5 供试品溶液的制备与测定

各批号复方益母口服液以0.45 µm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，分别精密量取续滤液2.0 mL，置10 mL容量瓶中，加入甲醇制成供试品溶液，进样10 µL。同时取对照品溶液10 µL进样，分别测定吸收峰面积，按外标法计算样品的含量。结果见表3。

2.6 系统适用性试验

理论塔板数：按照以上色谱条件，进样水苏碱对照品溶液10 µL，记录色谱图，水苏碱的保留时间为6.237 min，测得色谱柱的理论塔板数为6800。

分离度：取供试品溶液、阴性对照液，分别进样，水苏碱的保留时间为6.075 min，根据相邻最近峰的保留时间计算水苏碱的分离度 >1.5，符合中国药典的规定。阴性对照图谱在水苏碱色谱峰的保留时间无明显吸收峰（图1），表明处方中其他成分对水苏碱的测定无干扰。

图1 典型HPLC色谱图

A：对照品溶液  B：阴性对照溶液  C：供试品溶液

Figure 1 typical HPLC chromatographs

A: Standard Solution B: Negative Control Solution C: Sample Solution

2.7 标准曲线与线性范围

取对照品溶液，分别进样2.0、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0 µL，记录其色谱峰的峰面积。以峰面积对进样量作图，绘制标准曲线，结果水苏碱回归方程：Y = 978.2 X + 21.4，r=0.9997，线性范围：1.05 ~ 26.25 µg。

2.8 稳定性试验

取同一批供试品溶液（批号2008423），分别于0、2、4、8、12和24 h测定水苏碱含量，RSD为0.23%，说明供试品溶液在本实验条件下24 h内稳定。

2.9 精密度试验

取1份对照品溶液，重复进样5次，测定其峰面积。结果表明，实验精密度良好，RSD为1.23%。

2.10 重复性试验

取同一批供试品溶液（批号2008423），重复进样5次，测定水苏碱峰含量，结果表明，实验重复性良好，RSD为1.72%。

2.11 回收率试验

依2.5法，精密量取已知含量的复方益母草口服液（批号2008423）适量，按80%、100%和120%的比例，精密加入水苏碱对照品溶液适量，摇匀，进样测定，计算得平均回收率为98.1%，RSD=1.17% (n=9)。

表1 加样回收率试验结果

Table 1 the results of the recovery experiments

2.12 样品测定

分别精密量取对照品溶液和供试品溶液进样测定，按外标法以峰面积分别计算得3批口服液样品水苏碱的含量为0.71mg·mL^-1，RSD为2.23%。

3 讨论

3.1 复方益母口服液中含水苏碱、益母草碱、益母草定和益母草宁等多种生物碱，其中水苏碱为主要的活性成分，具有扩张外周血管、增加血流量、抗血小板凝集等作用，选择测定制剂中水苏碱具有代表性。

3.2 本文对HPLC的流动相进行过溶剂系统组成和比例等优化研究。生物碱类成分使用C18反相柱进行分析时，由于反相柱的封尾不完全，残存的微酸性硅醇基团会与生物碱类成分发生化学吸附而导致拖尾现象，而流动相中微量的酸能使生物碱类成分预先达到“酸饱合”的效果，减少了生物碱类成分与反相柱硅醇基的吸附，改善拖尾。经过比较发现，本文所采用的乙腈-0.05 mol·L^-1磷酸二氢钾溶液（18:83，pH 5.5），分离效果好，保留时间适当。

3.3 利用高效液相色谱法对复方益母口服液中的主要成分水苏碱进行含量测定，回收率高，操作简单，稳定性和重现性好，可以作为该制剂质量控制的新方法。

参考文献：

1．刘新华，辛宏，朱依谆。不仅是“益母”草：益母草的心脏保护作用，生理学报，2007，59(5): 578-584。

2．益母口服液-含量测定项：紫外分光光度法，中国药典2005版，P576。

3．唐盈，王晓强。四种含益母草中成药中水苏碱的含量测定，药物分析杂志，1989，9(1): 22-24。

4．张玲，时延增，于宗渊等。双波长薄层扫描法测定益母口服液中水苏碱的含量，中国药科大学学报，1996，27(1): 16-18。