高效液相色谱法与薄层扫描法测定复方益母口服液中盐酸水苏碱含量的比较

摘要  目的：建立高效液相色谱法测定复方益母口服液中盐酸水苏碱含量，并与薄层扫描法比较。方法：以Kromasil C₁₈ (5 µm，250 mm×4.6 mm)为色谱柱，乙腈-0.05 mol·L^-1磷酸二氢钾溶液（18:82，pH 5.5）为流动相，流速1.0 mL·min^-1，柱温35℃，检测波长215 nm，以外标法计算含量。结果：盐酸水苏碱含量在1.05 ~ 26.25 µg具有良好的线性关系，r=0.9997，样品平均加样回收率为98.3% (n=9)，RSD为1.17%，重复性试验RSD为 1.72% (n=5)，精密度试验RSD为 1.23% (n=5)。结论：本方法简便，结果准确可靠，重现性好，可替代薄层扫描法作为控制该制剂质量的主要方法。

关键词  复方益母口服液，盐酸水苏碱，高效液相色谱法

Abstract  Objective: to establish a HPLC method for the determination of stachydrine hydrochloride in Complex Yimu Oral Solution, and compare the results by HPLC and TLCS. Methods: Kromasil C₁₈ (5 µm，250 mm×4.6 mm) was used, and CH₃CN- 0.05 mol·L^-1 KDP (18:82, pH 5.5) was used as the mobile phase, with the flow-rate at 1.0 mL·min^-1. Oven temperature was 35℃, and the detective wavelength was 215 nm. Results: stachydrine was well separated from the other impurities, with the standard curve linear range of 1.05 ~ 26.25 µg, r=0.9997. The average recovery of stachydrine was 98.3% (n=9), RSD=1.17%. The results of reproducibility was good, with RSD=1.72% (n=5). The accuracy experiment was also good, with RSD=1.23% (n=5). Conclusion: the HPLC method is much more simple, convenient, reliable and sensitive than TLCS method, and could be used as the main quality-control method for the Complex Yimu Oral Solution.

Key words  Complex Yimu Oral Solution, Stachydrine Hydrochloride, HPLC

作为一种传统的妇科良药，益母草性味辛、苦，微寒，具有活血化淤、调经利水之功效，常用于妇女月经不调、痛经、难产，以及跌打损伤、水肿和疮疡肿毒等症。现代药理研究发现，益母草中益母草碱、水苏碱等多种活性生物碱也具有改善心肌缺血、增加冠状动脉血流、提高心功能，抑制血小板聚集、抗凝、抗血栓形成等多种作用，且作用持久^[1]。

复方益母口服液是由益母丸（中国药典1977年版）剂型改进而成，其中主要有效成分盐酸水苏碱是益母草中生物碱类含量测定的指标性成分，2005版药典采用薄层扫描法对其进行测定，不仅操作过程繁琐、所需时间长，而且水苏碱在湿度大时稳定性差^[2-5]。本文将高效液相色谱法与薄层扫描法测定复方益母口服液中主要有效成分盐酸水苏碱含量结果进行了比较，表明高效液相色谱法简便，结果准确可靠，重现性好，可作为控制该制剂质量的主要方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilengt 1200 系列高效液相色谱系统（Agilent Co. Ltd.，USA），G1376A高效液相泵，G1367B自动进样器，G1316A柱温箱，G1365B多波长UV检测器，Hystar色谱工作站。薄层色谱扫描仪（CAMAG，SWI）；硅胶GF₂₅₄预制薄层板（青岛海洋化工厂）；复方益母口服液（山东省临沂银雀山制药厂，10 mL·支^-1，批号2008211，2008423，2008512）；盐酸水苏碱对照品（中国药品生物制品检定所提供）；乙腈（色谱纯，江苏汉邦科技有限公司），水为二次重蒸水，其他试剂均为分析纯（山东禹王化学试剂有限公司）。

1.2 高效液相色谱法

1.2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱为Kromasil C₁₈ (5 µm，250 mm×4.6 mm，天津琛航科技仪器有限公司)；流动相为乙腈-0.05 mol·L^-1磷酸二氢钾溶液（18:82，pH 5.5），流速1.0 mL·min^-1，检测波长215nm，柱温35℃，进样量10 µL。

按照以上色谱条件，取对照品溶液、供试品溶液和不含益母草的阴性对照溶液各10 µL注入液相色谱仪，记录色谱图，盐酸水苏碱的保留时间为6.237 min，色谱柱的理论塔板数为6800；盐酸水苏碱与相邻峰的分离度 >1.5，符合中国药典的规定。阴性对照图谱在盐酸水苏碱色谱峰的保留时间无干扰色谱峰（图1）。

1.2.2 对照品溶液的制备

精密称取105℃干燥至恒重的盐酸水苏碱对照品适量，置5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得0.5 mg·mL^-1的对照品溶液^[6]，摇匀，备用。

1.2.3 供试品溶液的制备

各批号复方益母口服液以0.45 µm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，分别精密量取续滤液2.0 mL，置10 mL容量瓶中，加入甲醇制成供试品溶液，进样10 µL。

1.2.4 标准曲线与线性范围

取对照品溶液，分别进样2.0、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0 µL，记录色谱峰面积。以峰面积对进样量作图，绘制标准曲线，结果盐酸水苏碱回归方程：Y = 978.2 X + 21.4，r=0.9997，线性范围：1.05 ~ 26.25 µg。

1.2.5 稳定性试验

取同一批供试品溶液（批号2008423），分别于0、2、4、8、12和24 h测定盐酸水苏碱含量，RSD 为0.23%，说明供试品溶液在本实验条件下24 h内稳定。

1.2.6 精密度试验

取1份对照品溶液，重复进样5次，测定其峰面积，RSD为1.23%，结果表明仪器精密度良好。

1.2.7 重复性试验

取供试品溶液（批号2008423）5份，按照1.2.3项下进行处理后，分别进样测定盐酸水苏碱峰含量，RSD为1.72%，结果表明方法重复性良好。

1.2.8 回收率试验

精密量取已知含量的复方益母草口服液（批号2008423）适量，按80%、100%和120%的比例，精密加入盐酸水苏碱对照品溶液适量，摇匀，进样测定，计算得平均回收率为98.3%，RSD=1.17% (n=9)。

1.2.9 样品含量测定

取同一批号样品（批号：2008423），依法制成供试品液，分别精密量取对照品溶液和供试品溶液进样测定，按外标法以峰面积计算盐酸水苏碱含量，见表1。

1.3 薄层扫描法

1.3.1 线性关系的考察

吸取1.2.2项下对照品溶液2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 µL点于同一硅胶GF254薄层板上，展开后扫描，展开剂为正丁醇-盐酸-水（8:2:1），显色剂为稀碘化铋钾试液，扫描波长215nm。以盐酸水苏碱点样量（µg）为横坐标，其对应的荧光点面积积分值为纵坐标，计算回归方程：Y = 2531.1 X + 1864.3，r=0.9831，线性范围：1.05 ~ 10. 51 µg。

1.3.2 样品含量测定

分别吸取各供试品液10 µL，对照品液 10 µL，点于同一薄层板上，展开，扫描，测量供试品与对照品吸收度积分值，测定，采用回归方程计算含量，结果见表1。

图2 对照品和供试品溶液薄层扫描图

1，2，4，5：供试品；3，6：盐酸水苏碱对照品

2 讨论

2.1 由表1可以看出，对于同一批号样品的含量测定结果，高效液相法较薄层扫描法更稳定。因为盐酸水苏碱湿度大时不稳定，容易发生降解，且不同批次薄层板的质量差异、显色条件等诸多因素影响，导致薄层扫描法对于盐酸水苏碱的定量会有一定的偏差，所以采用高效液相色谱法更为准确。

2.2 曾对薄层展开条件进行了优化，最后选定展开剂为正丁醇-盐酸-水（8:2:1）可以得到较为满意的分离度。本文还对HPLC的流动相进行了溶剂系统组成和比例等优化，结果采用乙腈-0.05 mol·L^-1磷酸二氢钾溶液（18:83，pH 5.5），分离效果好，保留时间适当。

2.3 利用高效液相色谱法对复方益母口服液中的主要成分盐酸水苏碱进行含量测定，操作简便，回收率高，稳定性和重现性好，可以作为该制剂质量控制的新方法。

图1 典型HPLC色谱图

A：对照品溶液  B：阴性对照溶液  C：供试品溶液

表1 样品测定结果( mg·mL^-1)

参考文献：

1．刘新华，辛宏，朱依谆。不仅是“益母”草：益母草的心脏保护作用， 生理学报，2007，59(5): 578-584。

2．益母口服液-含量测定项：紫外分光光度法，中国药典2005版，P576。

3．唐盈，王晓强。四种含益母草中成药中水苏碱的含量测定，药物分析杂志，1989，9(1): 22-24。

4．张玲，时延增，于宗渊等。双波长薄层扫描法测定益母口服液中水苏碱的含量，中国药科大学学报，1996，27(1): 16-18。

5．姜舜尧，黄晓强，陆蕴如。几种中药生物碱的毛细管区带电泳分析，现代药物分析论坛（香港），世界医药出版社，1999，P28。